Hemaglutynacja bierna
Dodane przez pasqdnik dnia Czerwiec 04 2010 21:23:48
Hemaglutynacja bierna – modyfikacja aglutynacji, pozwala na oznaczenie miana przeciwciał odpornościowych skierowanych przeciwko antygenom nieupostaciowionym – rozpuszczalnym. W teście antygeny te należy upostaciować tzn. opłaszczyć na obojętnym nośniku – erytrocytach baranich. Jeżeli w surowicy badanej są obecne przeciwciała odpornościowe skierowane przeciwko badanemu antygenowi nastąpi ich przyłączenie do antygenu opłaszczonego na krwinkach. Powstanie kompleks antygen-przeciwciało widoczny w postaci delikatnych strątów – rozetek. W przypadku braku przeciwciał krwinki swobodnie będą sedymentować na dno otworka tworząc „guzik”.

Etapy:

1.Przygotowanie krwinek baranich i opłaszczenie – nośnika dla antygenu

pobranie krwi od barana do szklany butelek ze szklanymi perełkami
wytrząsanie w celu mechanicznego naruszenia włóknika (odwłókniona krew nie krzepnie)
pobieramy parę ml
wirowanie pobranej objętości przez 10min w 2000rpm
surowicę po wirowaniu odrzucamy
krwinki płuczemy 3 razy w NaCl, by wypłukać popękane erytrocyty i Hb
po płukaniu wirujemy i za każdym razem odrzucamy supernatant

otrzymujemy masę krwinkową – czyste krwinki

przygotowujemy krwinki 5% i 2,5% (krwinki kontrolne)
z 5% przygotowuje się przez zmieszanie równych objętości krwinek 5% i 0,9% NaCl
antygenem jest LPS z G- Salmonella typhimurium
0,5 ml 5% krwinek mieszamy z 0,5ml LPS 1mg/ml
inkubacja 50min w 37°C (opłaszczanie)
wirowanie 5min w 2000rpm
odrzucamy supernatant
masę krwinkową 2 razy płuczemy NaCl by wypłukać niezwiązany LPS
do masy krwinkowej dodajemy NaCl w takiej objetości, żeby mieć 2,5% krwinki opłaszczone

otrzymujemy 2,5% krwinki opłaszczone

2.Przygotowanie surowicy badanej

przygotowanie 1,5ml surowicy o rozcieńczeniu 1:5 (300μl surowicy + 1200μl NaCl)
inkubacja 20min w 56°C w celu inaktywacji dopełniacza

Dopełniacz – to grupa białek surowicy ludzkiej, które nieswoiście łączą się z kompleksem antygen-przeciwciało powodując ich rozpad (taki rozpad fałszowałby wyniki)

Absorpcja przeciwciał odpornościowych przeciw krwinkom baranim

Nośnik dla antygenów czyli erytrocyty baranie muszą być obojętne dla surowicy badanej – jeśli w surowicy są obecne przeciwciała anty-baranie erytrocyty należy je usunąć – zaabsorbować.

do surowicy dodajemy masę krwinkową w takiej objętości w jakiej dodano surowicę do przygotowania jej rozcieńczenia 300μl
inkubacja 15-60min w 37°C

Jeśli są przeciwciała przeciw krwinkom baranim przyłączą się one do erytrocytów

wirowanie 5min w 2000rpm – osadzenie kompleksów na dnie probówki

Przygotowanie rozcieńczeń surowicy badanej

Seria 10 kolejnych rozcieńczeń w postępie geometrycznym 1:10 → 1:5120

do 10 probówek dodajemy 1,5ml NaCl
surowicę przenosimy po wirowaniu do 1 probówki
do każdej następnej dodajemy 1,5ml z poprzedniej probówki

Każde następne rozcieńczenie 2 razy wyższe niż poprzednie

3.Odczyn właściwy

Płytka plastikowa z rzędami 11 otworków

do otworka 1-10 w 1 i 2 rzędzie dodajemy 0,5ml surowicy badanej
do 11 otworków dodajemy 0,5ml NaCl
do wszystkich otworków w 1 rzędzie dodajemy 50μl 2,5% krwinek opłaszczonych
do wszystkich otworków w 2 rzędzie dodajemy 50μl 2,5% krwinek nieopłaszczonych
inkubacja 24h w temperaturze pokojowej

Miano 1 rzędu to odwrotność najwyższego rozcieńczenia badanej surowicy przy którym widoczny jest wynik dodatni. We wszystkich otworkach 2 rzędy powinny być widoczne „guziki”, czyli wyniki ujemne.

W 11 otworkach sprawdza się czy krwinki nie ulegają pseudoaglutynacji – aglutynacji pod wpływem rozpuszczalnika.
Więcej na iuczelnia.edu.pl

W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia Państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczane w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies.