Fagocytoza
Dodane przez pasqdnik dnia Czerwiec 04 2010 21:28:51
FAGOCYTOZA

Proces fagocytozy polega na pochłanianiu antygenów przez komórki żerne (fagocyty). Antygeny to cząstki kom. lub związki odczytywane przez organizm jako obce.
Komórki żerne: monocyty, granulocyty kwaso- i obojętno- chłonne krążące we krwi oraz makrofagi osiadłe w narządach wewnętrznych.

Etapy fagocytozy:
chemotaksja – kom. żerne z prądem krwi docierają do miejsca zakażenia
rozpoznanie antygenów – antygeny są rozpoznawane przez specyficzne receptory na pow. komórek żernych a następnie przyłączone przez receptory do fagocytów (kom. żernych). Rozpoznanie jest ułatwione przez przyłączenie do antygenów opsonin. Mogą to być składowe części dopełniacza z surowicy lub przeciwciała odpornościowe.
endocytoza – pochłanianie antygenów. Otoczenie błoną kom., wytworzenie wodniczek, do których przyłączają się lizosomy i tworzą się fagolizosomy.
degradacja antygenu – biorą w niej udział dwa mechanizmy:
mechanizm zależny od tlenu – należy do niego wytwarzanie H2O2, rodników - supertlenkowego czy anionu hydroksylowego, oraz produkcja NO. Związki silnie utleniające, powodujące oksydacyjną degradację antygenu
mechanizm niezależny od tlenu – wytwarzanie enzymów (hydrolaz, lizozymu) oraz niskie pH.


IZOLACJA FAGOCYTÓW

krew pełną rozcieńczyć 1:1 w PBS (Phosphate Buffered Saline; zbuforowany fosforanami roztwór NaCL izotoniczny z komórkami ssaczymi) → 2ml krwi i 2ml PBS
do probówki wirowniczej dodać 4ml gradisolu (mieszaniny fikolu i uropoliny) – służy on do izolacji komórek krwi w czasie wirowania różnicowego
na gradisol nanosimy 4ml krwi (krew lejemy po ściance aby powstały 2 warstwy)
wirujemy w 3000rpm przez ½ h
gradisol utrzyma się w postaci zawiesiny o różnych gęstościach, patrząc od dna będą to:
erytrocyty
pasek granulocytów
monocyty i limfocyty
rozpuszczalne białka surowicy
po wirowaniu usuwamy warstwy górne (potrzebujemy granulocyty i monocyty)
dodajemy 5ml PBSu aby odpłukać gradisol i wirujemy 10 minut w 2000rpm
odrzucamy supernatant a do osadu dodajemy 200µl PBSu → otrzymaliśmy zawiesinę komórek żernych


BADANIE IN VITRO AKTYWNOŚCI FAGOCYTÓW – OZNACZANIE INDEKSU FAGOCYTARNEGO

w PBS-ie przygotowujemy zawiesinę bakterii wg zmętnieniowej skali McFarlanda nr 2 (106 – 108 bakterii)
do zawiesiny komórek żernych dodajemy zawiesinę komórek bakterii 1:1 (po 200µl)
inkubujemy ½ h w 37°C, w tym czasie komórki żerne pochłaniają bakterie, im większa jest aktywność fagocytów tym więcej bakterii pochłoną
wykonujemy rozmaz – na szkiełko podstawowe nanosimy 10µl próby badanej i rozprowadzamy drugim szkiełkiem

czekamy do wyschnięcia próby na szkiełku a następnie utrwalamy w metanolu (5 minut) i czekamy do osuszenia
zalewamy rozcieńczonym odczynnikiem Giemsy na 15 minut lub rozcieńczonym odczynnikiem Mansona na 1 minutę
spłukujemy wodą i osuszamy w bibule
nakładamy olejek imersyjny i obserwujemy, liczymy bakterie sfagocytowane i komórki żerne; podstawiamy do wzoru:
norma u zdrowego wynosi 1±0,36


TEST POCHŁANIANIA I REDUKCJI NBT (BŁEKIT NITROTETRAZOLIOWY)

Test pochłaniania i redukcji błękitu nitrotetrazoliowego służy do oceny aktywności komórek żernych, szczególnie do określenia zdolności fagocytów do wytwarzania H2O2 i rodników tlenowych w procesie degradacji antygenu.




H2O2 przy silnym utleniaczu jest reduktorem i powoduje redukcję żółtego NBT do ciemnofioletowego formazanu.

mieszamy krew z NBT w proporcji 1:1
inkubujemy ½ h w 37°C
wykonujemy rozmaz i utrwalenie tak samo jak w poprzednim punkcie
liczymy ilość komórek żernych ze złogami ciemnofioletowego formazanu i przeliczamy na 100 komórek

U zdrowego człowieka ilość komórek żernych aktywnych metabolicznie wynosi 9 – 15%, w obecności licznych bakterii lub wirusów liczba ta rośnie, w kuracjach przeciwzapalnych np. kortykosterydami lub aspiryną liczba ta maleje.


Więcej na iuczelnia.edu.pl

W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia Państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczane w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies.